Der Iltis ist bevorzugt dämmerungs- und nachtaktiv. Nur während der Aufzucht der Jungen ist er auch ausnahmsweise tagaktiv. Tagsüber versteckt sich der Iltis in Holzstößen, Strohhaufen, Scheunen und Kaninchenbauen. Iltisse graben selten eigene Baue. Diese werden dann bevorzugt an Böschungen und Grabenrändern angelegt. Iltisse klettern ungern. Insbesondere während der Ranzzeit markieren Iltisse ihr Revier durch Absetzen von Harnmarken und Verteilen des Analdrüsensekretes (hierzu rutschen sie mit dem Hinterteil auf dem Boden entlang). Der Iltis gilt als standorttreu, obwohl er bei seinen Beutezügen Entfernungen bis zu 10 km zurücklegt.

Der Iltis erbeutet seinen Fraß als Stöberer und Bodenjäger. Die Beute wird durch Nackenbiss getötet. Iltisse legen Vorratslager (Winterlager) an. Diese bestehen in der Regel aus durch Nackenbiss gelähmte Frösche und Kröten. Seine Vorratskammern legt der Iltis in Uferhöhlen (z. B. Bisambaue) und erweiterten Maulwurfsgängen an.